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易错PCR（Error-Prone PCR）是利用天然Taq DNA聚合酶不具有3'→5'校对功能的特性，在一定条件下（如不同的dNTP浓度、Mg²⁺浓度和MnCl2存在）能够按较高的机率随机引入突变而设计。如果有适当的突变选择方法，则可从构建的突变库选出所需突变体，用于人工诱变。但是易错PCR在操作中最大的问题是最佳PCR循环数的摸索，循环次数太多或太少，都得不到成形的突变DNA条带，影响后续的DNA回收和克隆步骤。为克服此缺点，本公司开发了染料法实时易错PCR产品。

• 即开即用，十分简单方便。
  
• 可以实时监控PCR的进程，用户可以不需要任何摸索就能在最佳时间（荧光信号刚进入平台期）停止PCR，立即进行电泳，回收到突变DNA。
  
• 配方经过精心优化，突变率稳定，在0.66%左右（±0.13%）。主要引入点突变，一般不会引入插入或缺失突变。
  
• 比体内基因突变更快捷简单，但如果在PCR引物中设计位点，则可使产物克隆到表达载体，也可以用于体内蛋白活性的筛选。
  
• 可用于连续易错PCR（sequential error-prone PCR），只需把上一次易错PCR的产物用作下一次易错PCR的模板即可，使每一次获得的小突变累积而产生重要的有益突变。
  
• 只适用于扩增1kb以下的产物，对于1kb以上的产物，建议分段扩增。
  
• 本制品足够100次30μL体系的染料法实时易错PCR反应。
  
• 本制品只能用于科研。

• 将自备的PCR引物稀释到10μM。引物是决定易错PCR成败的关键因素，设计引物时要保证其Tm在70℃，长度在25～30nt之间，GC含量在45%～60%之间，3端GC含量低，并且没有发夹结构。
  
• 用自备引物和自备的常规PCR试剂扩增制备易错DNA模板（常规PCR产物），胶回收并准确确定浓度。
  
  • 易错PCR的模板一定要用胶回收的常规PCR产物，因为胶回收可以把电泳不可见的非特异性扩增片段去除，否则这些片段由于也是用易错PCR引物扩增所得，在易错PCR扩增时也会被扩增，产生竞争抑制，降低靶分子的扩增效率。
    
  • 如果常规PCR制备模板的引物和易错PCR引物不同（类似巢式PCR）则可以避免此问题，但需要合成两对引物。
    
  • 本试剂盒只适用于扩增1kb以下的产物，对于1kb以上的产物，建议分段扩增。
• 将回收的DNA片段（模板）用水稀释到1ng/μL、10ng/μL和100ng/μL三个浓度。
  
  • 模板使用量是影响突变率的最重要因素，因为模板DNA为非突变DNA，扩增产生的DNA为突变DNA，易错PCR体系跟常规PCR一样，最后会达到扩增平台，最终得到的扩增DNA的量是固定的，因此起始模板DNA使用量越大，则突变DNA在最终得到的总DNA中的相对比例就越低。但模板太少又不容易扩增成功，所以建议同时测试三个模板用量。如果都成功，则优先选用模板浓度低的PCR产物进行分析。
• 设置30μL体系的易错PCR反应。在干净的PCR管中，分别加入下列成分。由于Mn²⁺容易跟其他成分发生沉淀反应，因此上机前最后加MnCl2。
  

  成分	管1	管2	管3
  10×染料法实时易错PCR Mix(含酶)	3μL	3μL	3μL
  自备DNA模板	1μL(1ng/μL)	1μL(10ng/μL)	1μL(100ng/μL)
  自备易错PCR引物(10μM each)	各1μL	各1μL	各1μL
  易错PCR增强剂	3μL	3μL	3μL
  易错PCR专用dNTP	3μL	3μL	3μL
  易错PCR专用MnCl2	3μL	3μL	3μL
  超纯水	至30μL	至30μL	至30μL

• 立即按下列参数进行易错PCR：
  

  步骤	参数	循环数
  PCR前变性	94℃ 3min	循环1次
  染料法实时易错PCR	94℃ 1min	循环60次，在72℃时采集SYBR Green I通道的荧光信号
  	60℃ 1min
  	72℃ 3～10min

  • 由于易错PCR含高浓度的镁离子，因此引物容易互为模板形成引物二聚体，因此使用60℃为复性温度。在错误碱基掺入后，DNA合成会暂时停滞，因此为了让DNA合成继续，需要延长合成的时间到3～10分钟。易错PCR循环次数越多，突变DNA（扩增产物）与非突变DNA（原始模板）的比例就越高。此外在突变率和模板长度恒定的情况下，扩增次数越多，发生突变的绝对数就越高，在同一模板上发生的突变位点数就越多。但循环次数过多，又得不到完成的DNA条带，没法进行后续的克隆。所以可以设置60次循环并不表示要完成60次，而是需要在荧光信号不再增长，进入平台期后立即停止易错PCR并进行电泳回收。
• 易错PCR结束后，立即电泳检测。如果扩增产物长度正确，则进行胶回收，再进行克隆和测序等后续操作。如果需要增加突变率，可以选择一个突变后的DNA为模板，再进行下一轮易错PCR。
  
• 如果没有扩增，则按下列操作进行追加PCR。
  
• 在易错PCR管中，加入3μL追加dNTP到27μL剩下的染料法实时易错PCR体系中，按下表进行追加实时PCR（chasing Real-Time PCR）。
  

  步骤	参数	循环数
  追加实时PCR	94℃ 1min	循环20次，在72℃时采集SYBR Green I通道的荧光信号
  	60℃ 1min
  	72℃ 1min

• 追加实时PCR荧光信号进入平台期后立即结束PCR，并不需要等到20个循环结束，并进行电泳检测。如果有DNA条带并且长队正确，则再进行克隆和测序等后续操作。如果需要增加突变率，可以选择一个突变后的DNA为模板，再进行下一轮易错PCR。
  
• 如果没有预期大小的PCR产物，则需要分析原因。